Phương pháp nghiên cứu – Phương pháp RP-HPLC

Thứ tự ra khỏi cột

Hợp chất có ái lực nhiều với pha động thì có xu hướng ra khỏi cột trước

Hợp chất có ái lực nhiều với pha tĩnh thì bị giữ lại lâu hơn trong cột và ra sau

Dụng cụ và hoá chất

Máy móc và dụng cụ

Máy HPLC model LC-10A của hãng Shimadzu

Hoá chất

Catrige lọc với kích thước mao quản 0,45mm ; 0,2mm , bể siêu âm, tủ lạnh, máy điều nhiệt, tủ sấy, máy sinh khí nitơ, cột chiết pha rắn SPE-C18, và các dụng cụ thí nghiệm thông dụng khác. Dung dịch đệm được pha từ axit acetic và natri acetate, dung dịch được lọc qua màng lọc 0,45mm trước khi bơm vào cột sắc ký.Máy đo pHCác chất chuẩn PEN G, AMP.3H2O, CLO (Na), CEP.H2O, OXA, do Viện kiểm nghiệm Bộ Y tế ( 48A Hai Bà Trưng – Hà Nội) sản xuất và cung cấp.MeOH, ACN tinh khiết cho chạy HPLC Merck (Đức). Các hoá chất khác: axit acetic, natri acetate, axit boric, HCl, KOH tinh khiết phân tích và nước cất 2lần.

Máy đo quang phổ tử ngoại khả kiến UV-1650 PC

Khảo sát các điều kiện chạy sắc ký

Chọn pha động

– Dung môi sử dụng MeOH, ACN,… và dung dịch đệm acetat

– Điều kiện khảo sát ban đầu:MeOH/ACN/đệm acetat 10mM là: 15/15/70 ; pH = 4

– Tốc độ 0,8ml / phút Chọn thể tích vòng mẫu

Phân tích thuốc kháng sinh chúng tôi chọn van bơm mẫu 6 chiều với thể tích vòng mẫu là 20Chọn cột Supelcosil RP-C18 kích thước 250mm × 4,6mm đường kính hạt nhồi 5m của hãng Sulpenco – Australia được chọn để tách các chất trên.Chọn pha tĩnh

Điều kiện khảo sát: ACN/MeOH/đệm Acetat = 15/15/70. Tốc độ 0.8ml/phút. Nồng độ đệm 10mM– 5,0.PEN G, CEP, AMP, OXA, C .Thứ tự rửa giải của các b-lactam là :

 Tại pH = 3,5 các píc sắc ký có sự khác nhau rõ rệt về hệ số tách k’, sự tách rõ ràng hơn, thời gian lưu ngắn hơn. Như vậy, kết quả chọn pH = 3,5 cho các thí nghiệm tiếp theo. Khảo sát thành phần dụng dịch đệm CH3COOH/CH3COONa có nồng độ 10mM với khoảng pH thay đổi từ

Ưu nhược điểm của phương pháp

Điện di mao quản Sắc ký lỏng hiệu năng cao Điện hoá
– Xác định được trên nhiều đói tượng
– Lượng mẫu phân tích nhỏ

– Thao tác đơn giản
– Chi phí không cao
– Phân tích được nhiều chất – Phân tích được nhiều mẫu – Chỉ phân tích từng mẫu cùng một lúc cùng một lúc đơn lẻ
– Giới hạn phát hiện và định lượng thấp lượng cao hơn phương pháp định lượng điện di.

Kết luận

Khảo sát và chọn được thông số tối ưu cho quá trình chạy sắc ký:

1. Pha tĩnh: Cột Supelcosil RP-C18 với kích thước hạt nhồi 5m hãng Sulpenco-Autralia

2. Pha động:✓ pH = 3,5
✓ Tỷ lệ ACN / MeOH / đệm acetat là 10/20/70✓ Nồng độ đệm 10mM✓ Tốc độ 0,8ml/phút

3. Chạy đẳng dòng

4. Nhiệt độ cột tách 30oC
5. Thể tích mẫu 20l

6. Detector đơn bước sóng tại 225nm