các phương pháp sắc kí 2
Contents
Sắc ký pha đảo
Pha tĩnh trong sắc ký pha đảo
Nhiệm vụ: Tách sắc ký một hỗn hợp chất phân tích
Yêu cầu:
+ Phải trơ và bền dưới tác dụng của các điều kiện môi trường sắc ký, không có các phản ứng hóa học phụ với dung môi rửa giải hay với chất phân tích, đảm bảo cơ chế tách theo đúng bản chất của pha tĩnh và không làm mất chất phân tích cần tách
+ Có tính chọn lọc một hỗn hợp chất tan nhất định trong điều kiện sắc ký nhất định của hệ pha HPLC
+ Tính chất bề mặt phải ổn định, độ xốp không bị biến dạng trong quá trình sắc ký, không bị phân rã dưới áp suất cao của quá trình sắc ký
+ Cân bằng động học của sự tách sắc ký phải xẩy ra nhanh, thuận nghich và lặp lại tốt
+ Cỡ hạt tương đối đồng nhất để cột tách có hiệu lực tách cao
Pha tĩnh là những hợp chất hữu cơ được gắn lên chất mang rắn silica hoặc cấu thành từ silica theo hai kiểu:
Pha tĩnh được giữ lại trên chất mang rắn bằng cơ chế hấp phụ vật lý → sắc ký lỏng-lỏng (liquid-liquid chromatography).
Pha tĩnh liên kết hóa học với chất nền → sắc ký pha liên kết (bonded phase chromatography)
Sắc ký pha liên kết có nhiều ưu điểm hơn sắc ký pha lỏng-lỏng
Sắc ký pha liên kết có nhiều ưu điểm hơn sắc ký pha lỏng-lỏng
Pha tĩnh trong hệ sắc ký lỏng-lỏng dễ bị hòa tan bởi pha động nên dễ bị mất mát pha tĩnh trong thời gian sử dụng và gây nhiễm đối với hợp chất phân tích.
Do pha tĩnh của sắc ký lỏng-lỏng dễ tan trong pha động nên
người ta không thể ứng dụng phương pháp rửa giải gradient dung môi
* Thành phần cấu tạo
Pha tĩnh trong sắc ký pha đảo HPLC chính là chất nhồi cột, nó là những chất rắn, xốp và kích thước hạt rất nhỏ, diện tích bề mặt riêng lớn . Bề mặt các hạt silica – SiO2 (các hạt này có đường kính 3, 5 hoặc 10 µm) được xử lý (thủy phân) bằng cách đun nóng với HCl 0,1M trong một hoặc hai ngày để tạo ra những nhóm SiOH như
Bề mặt silica đã thủy phân sau (thông thường chỉ có khoảng 8 µmol SiOH/m2 bề mặt)
Sau đó bề mặt silica đã thủy phân này sẽ được cho phản ứng với các organochlorosilan để tạo ra các pha tĩnh không phân cực, phân cực trung bình hoặc rất phân cực tùy theo nhóm R gắn vào.
Trong SKPĐ, nhóm thế R trong hợp chất siloxan hầu như không phân cực hoặc ít phân cực. Đó là các ankyl dây dài như C8 (n-octyl), C18 (n-octadecyl) còn gọi là ODS (octadecylsilan) hoặc các nhóm alkyl ngắn hơn như C2; ngoài ra còn có cyclohexyl, phenyl trong đó nhóm phenyl có độ phân cực cao hơn nhóm alkyl. Người ta nhận thấy các alkyl dây dài cho kết quả tách ổn định hơn các loại khác nên sử dụng nhiều nhất. Không sử dụng được trong môi trường quá acid (pH < 2) hoặc trong môi trường bazơ (pH > 7)
Cấu trúc của cột ODS
Dùng các chất như trimethylchlorosilan ClSi(CH3)3 hoặc hexamethyldisilazan (ít sử dụng hơn) để tương tác với nhóm –OH này. Lúc này ta sẽ có loại cột ít tương tác với chất phân tích có tính bazơ (cột LC-DB của hãng
SUPELCO).
Cấu trúc cột LC-DB
Thế bằng những nhóm thế lớn hơn như isopropyl để những nhóm này sẽ che đi những nhóm –OH, cản trở tương tác của nhóm –OH với chất cần phân tích
Cấu trúc cột có gốc isopropyl
Người ta còn ghép lên dây C18 một số nhóm phân cực để tăng thêm độ phân cực của dây C18, làm cột có khả năng tách chọn lọc hơn đối với những hợp chất phân cực mạnh (cột EPS – Expended Polar Selectivity).
Ngoài sườn silica, thời gian gần đây người ta có sử dụng đến nền nhựa polystyren (Polystyren Reversed Phase – PRP) cho phép phân tích trong môi trường pH từ 1 – 13. Cột này dễ sử dụng trong môi trường acid và bazơ mạnh.
* Yêu cầu:
Hòa tan mẫu phân tích
Phải trơ với pha tĩnh
Phải bền vững theo thời gian
Có độ tinh khiết cao
Nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký
Phù hợp với loại detecter để phát hiện chất phân tích
Có độ nhớt thấp để tránh áp suất dội lại cao
Có tính chất kinh tế, không quá đắt, quá hiếm
Thành phần: Trong sắc ký pha đảo, dung môi pha động có độ phân cực cao. Trên lý thuyết chúng ta có thể sử dụng khá nhiều dung môi nhưng kinh nghiệm thực tế cho thấy methanol (MeOH), acetonitrile (ACN) và tetrahydrofuran (THF) là đạt yêu cầu nhất Thông thường pha động kết hợp một hỗn hợp nước hoặc dung dịch đệm với một hoặc nhiều dung môi hữu cơ phân cực tan được trong nước. Nước là một dung môi rất phân cực nên nó không tương tác với những nhóm alkyl không phân cực trong pha tĩnh, do đó nó được coi như pha động yếu nhất và có tốc độ rửa giải chậm nhất trong tất cả các dung môi động của SKPĐ
